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2023年9月12日，广东工业大学许燕滨教授团队在Nature子刊、环境领域TOP期刊《The ISME Journal》上发表了题为“Oxytetracycline and heavy metals promote the migration of resistance genes in the intestinal microbiome by plasmid transfer”的论文，文章第一作者为林晓君博士。该研究利用爪蟾肠道菌群确定了重金属与抗生素土霉素对质粒载体的抗性基因水平转移在肠道微生物中的影响。长光辰英核心产品——P300及PRECI SCS-F可视化荧光单细胞分选仪，有幸为本研究中水平转移共轭体系中不可培养共轭菌的鉴定和分离验证提供了有力工具。
抗生素能够在亚抑制浓度下对环境中的微生物进行自然选择，进而得到抗生素耐药株(ARBs)。目前，在人类共生生物和病原体中已检测到来自环境的抗生素耐药基因(ARGs)。水平基因转移(HGT)是介导抗生素耐药基因在微生物及宿主中传播的主要途径。其中，接合作为一种HGT机制之一，主要指细菌细胞通过结合转移质粒、整合子、转座子等可移动遗传元件来传播ARGs。过去的研究表示，水生动物的肠道微生态系统容易发生ARGs的水平转移，并且环境重金属能够促进细菌对抗生素的耐药，因此，有必要研究ARBs和ARGs对肠道微生物组的影响，并评估重金属和抗生素联合存在的水生环境ARGs的水平迁移潜力。本研究建立了一个携带RP4质粒的多重耐药菌(供体)和热带爪蛙肠道微生物组(受体)组成的体外接合系统，探究了三种重金属(Zn、Cu、Pb)和一种抗生素(土霉素，Oxytetracycline，OTC)作为应激源的条件下，供体受体的细胞活力差异和HGT转移相关的各功能基因表达情况，来揭示重金属及土霉素对ARGs水平转移的潜在机制。
本研究以携带含有绿色荧光蛋白sfgfp的RP4质粒的大肠杆菌K12作为供体，该菌株已在基因组上整合了mCherry红色荧光蛋白，从而实现了双重荧光标记。同时分离出热带爪蛙肠道土著菌群作为受体，构建了一个完整的接合转移体系，通过设置三种重金属(Zn、Cu、Pb)和土霉素的单一及联合胁迫实验组，全面评估了重金属和土霉素对接合转移频率的影响。
该研究综合评估了接合转移体系中供受体活性响应、mRNA表达调控、抗氧化酶活及细胞膜表征等相关指标，揭示了不同环境因素(重金属与抗生素单一/联合胁迫)对HGT的影响机制。通过样品携带的荧光与拉曼光谱建库，对热带爪蛙肠道微生物组中HGT的优势受体细胞进行了分离与种属鉴定。
图1 实验流程示意图
土霉素和重金属的胁迫下ARGs更容易发生水平迁移，其中迁移频率主要取决于肠道受体菌的细胞活力。外膜蛋白基因和接合转移相关基因的mRNA表达的改变会提高水平迁移频率，其中包括ompC、traJ、traG基因的上调和korA基因的下调。此外，抗氧化酶活通过非特异性作用、协同抑制作用和特异性应激作用促进肠道细菌对有害重金属离子的抵抗力。对细菌表面进行进一步观察可以发现，土霉素和重金属胁迫会使细菌细胞膜表面出现大量的球状和丝状分泌物将细菌相互连接起来，同时，细菌细胞膜上还观察到颗粒状突起、小孔洞以及表面内陷的状态，这将有利于质粒DNA穿过细胞膜并驱动ARG向受体菌传播(图2)。
图2 土霉素和重金属促进肠道菌群中RP4质粒介导的水平机制
a细胞外膜通透性提高; b编码外膜蛋白基因表达增强;
c接合转移相关基因的调控; d胞内抗氧化酶活性提高; e受体菌活性抑制
2. 热带爪蛙肠道微生物组ARGs水平转移优势受体菌分离鉴定
为探究受体在ARGs水平转移过程中的接收菌种类，对接合转移体系中可培养与不可培养的转接合子进行了鉴定和qPCR检测，通过平板条纹法分离出可培养的接合子。为分离不可培养菌，该研究通过P300进行了拉曼光谱检测，建立细菌文库，进行t-SNE聚类分析，选取了离聚类树较远的单细胞进行分类识别，又通过PRECI SCS-F可视化荧光单细胞分选仪分离了只含有绿色荧光的不可培养的接合子(图3)，并通过16S验证了不可培养肠道接合子的物种组成。
图3 接合转移体系中不可培养菌分选
a：通过GFP(绿色)和mCherry(红色)模式下收集微生物群共聚焦荧光图像；b：分选前后对应的明场视图
综上所述，该研究发现，土霉素和重金属的存在能够提高受体菌的活性水平从而增加了接合转移的频率，并通过增强抗氧化酶活性进一步了调控结合转移基因ompC、traJ、traG的上调和korA基因的下调，由此导致了细菌表面形貌发生变化并提高了细胞膜的通透性，最终共同促进了肠道微生物中ARG的迁移与传播。另外，研究过程中利用热带爪蛙肠道微生物组作为受体细胞，经过分选后鉴定到了弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、气单胞菌属(Aeromonas sp.)、地芽胞杆菌属(Geobacillus sp.)等不可培养菌属，此类菌属可能在水生环境耐药菌的水平转移中起到重要作用。
原文链接：
P300激光共聚焦拉曼光谱仪，该仪器是长光辰英研制的一款高端科研级激光共聚焦拉曼光谱仪。仪器集高灵敏度、高稳定性为一体，内置独特的多维校正装置，保证样品光谱不受测试环境干扰，满足拉曼数据库构建对光谱稳定性的要求；全自动数据采集，大大提高科研效率；搭载深度学习算法，帮助用户自建专属数据库；HOOKE IntP智能分析软件，可帮助用户深度挖掘图谱内在信息。同时，P300具有强大的扩展功能，可为不同应用场景提供完整的解决方案。
PRECI SCS-F可视化荧光单细胞分选仪采用非接触式分离方式，可在显微成像系统下基于荧光信号实现原位、无损的活体细胞分离，分选后的细胞可进行培养。该仪器搭载了4个通道，能够涵盖市面上大部分常见的荧光染料，也可根据客户需求进行激发与发射波段的定制。对于不同环境/临床样品(土壤、海洋、肠道、污水等)，结合靶向性荧光探针，可快速、便捷地实现靶向微生物识别与筛选，适用范围广，为功能微生物筛选提供有力工具。
许燕滨，博士，广东工业大学教授，博士生导师，广东省千百十培养对象。中国生态学学会微生物生态专业委员会委员，全国高校分析测试研究会理事，中国分析测试协会高校分析测试分会常委。从事环境持久性污染物和新型污染物的环境分析与毒理特性研究，及生物强化治理技术与机理方面的教学与科研工作。主持国家自然科学基金项目4项、国家重点研发计划专项子课题1项、中国博士后自然科学基金项目1项、广东省自然科学基金面上项目和联合基金重点项目各1项、广东省重大应用型专项等5项；主持20余项企事业单位委托项目。担任近二十个国际刊物的审稿人，在国内外刊物上发表论文100余篇；授权发明专利18件，转让发明专利1件。获2021年环境技术进步二等奖和2022年省科技成果推广奖。
0431-81077008
